南宫28为您提供实验前准备的重要指南，以确保您在生物医疗研究中的成功。

1. 实验前准备

试剂准备：配制40% Percoll溶液的方法如下：

首先，将Percoll细胞分离液与PBS缓冲液（10×）按体积比9:1混合，形成等渗100% Percoll母液。接着，将100% Percoll母液与RPMI1640/1×PBS按体积比4:6混合，从而制备出40%等渗Percoll溶液。

此外，80% Percoll溶液的配制过程与以上相似，首先按9:1的比例混合Percoll细胞分离液与PBS缓冲液，得到等渗100% Percoll母液。随后以8:2的比例将100% Percoll母液与RPMI1640/1×PBS混合，得到80%等渗Percoll溶液。

2. 肠道固有层免疫细胞分离步骤

以下为具体操作步骤：

1. 使用颈椎脱臼法处死小鼠，并将其固定在手术台上。之后，用75%酒精消毒小鼠腹部，在正中纵向切开以暴露腹腔。
2. 在小鼠胃与十二指肠的连接处剪断，一边分离小肠周围的脂肪组织和肠系膜，一边将小肠拉出；再在小肠与盲肠的连接处剪断，从而分离出小肠。
3. 在10cm培养皿中加入5mL预冷至4°C的PBS，将小肠放入培养皿中润洗，并利用镊子和剪刀去除脂肪组织和派伊尔结。
4. 将小肠切成4段，用剪刀纵向剪开以暴露肠内容物，并轻轻刮除粘膜表面的肠内容物。
5. 将处理过的小肠转移到含有10mL HBSS+2% FBS的50mL离心管中，剧烈涡旋10-20秒。
6. 使用镊子取出小肠，重复清洗2次。
7. 将清洗过的肠组织剪碎成0.5cm的小片段，转移到2mL圆底管中，加入1mL小鼠肠道组织解离液，在37°C的摇床孵育60分钟（根据组织状况可适当延长孵育时间）。
8. 从摇床中取出圆底管，剧烈涡旋10-20秒，经过70μm细胞筛网过滤，用10mL PBS冲洗细胞筛网。
9. 将含有细胞的滤液收集到50mL管中，在20°C下以400g离心5分钟，弃上清液，用4mL 40% Percoll重悬细胞沉淀并转移至15mL离心管。
10. 按深层加入25mL 80% Percoll，轻微倾斜离心管，缓慢将4mL 40% Percoll与细胞混合物沿管壁加入，形成密度梯度。
11. 在800g、20°C下离心20分钟，升速和降速均设为1。
12. 离心结束后，将中间的白膜层免疫细胞吸取到新的15mL离心管中，加入3倍体积的预冷PBS，上下颠倒混匀，4°C下400g离心5分钟，弃上清。
13. 重复清洗步骤，最终得到肠道固有层淋巴细胞。
14. 使用细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀，并调整细胞浓度至5-10×10⁶ cells/mL，将100μL/管的细胞悬液分配到12×75mm的流式管中，准备后续实验。

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